密封性验证研究：微生物侵入法和真空衰减法的案例介绍

包装系统可分为直接接触药品的包装组件和次级包装组件，这两者共同确保产品的密封性。容器的密封性对产品的质量稳定具有关键作用，它能够预防内容物损失、微生物侵入以及受到氧气、水蒸气或其他物质的影响。根据药审中心发布的《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南（试行）》和《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求》，对于无菌制剂，需要选择适当且经过验证的密封性检测方法对样品进行监测。密封性优选能够确定产品**允许泄露限度的确定性方法。如果方法的灵敏度无法达到产品**允许泄露限度水平，建议至少采用两种方法进行密封性验证，其中一种推荐使用微生物挑战法。常用的密封性检测方法见表1。

表1 常见的密封性检测方法

对于无菌制剂而言，在产品开发阶段，需结合药品自身特点及生产设备综合考虑，选择合适的密封性检测方法，并对两种方法进行验证，进而在日常商业化生产中，选择灵敏度最高的方法对产品进行抽样检测。然而，对于熔封产品（如玻璃或塑料安瓿），应进行100%的密封性检测。一般出于便利性和商业化成本的考虑，可以选择微生物挑战法和色水法对产品的密封性进行研究。通过比较色水的浓度、检漏压力和时间等参数，选择开发出灵敏度更高的色水检测方法，并将其作为日常商业化密封性检测的方法。

如某产品选择中硼硅管制注射剂瓶作为容器、胶塞进行加塞密闭，铝塑组合盖轧盖的包装形式进行密封，同时参考USP<1207>等相关技术要求，可选择微生物侵入法和真空衰减法进行包装系统密封性研究。

（1）微生物侵入法

微生物侵入试验是对容器密封系统完好性的挑战试验，通过对菌种、菌液浓度、侵入压力和侵入时间等筛选，选择合适的微生物侵入法条件。在验证过程中，取缺陷短波单胞菌新鲜培养物，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，置30℃-35℃培养48h，再用胰酪大豆胨液体培养基进行10倍浓度稀释3次，进行菌液浓度检测，保证菌液浓度不小于106cfu/ml的要求。

取100个中硼硅管制注射剂瓶（其中50个为阳性打孔样品，分别由外部厂家打孔3.75µm，5µm，10µm，15µm，20µm，各孔径10个，分为5组），剩余50个随机分成10个一组，灌装胰酪大豆胨培养基（灌装量需与产品注射液一致），压塞和轧盖将容器密封。将灌装后的容器经121℃ 15min灭菌。取出试样冷却，倒置使培养基与容器密封处充分接触，在30℃~35℃下倒置培养14天，检查是否有微生物侵入，以确定容器密封系统的完好性；所有试样培养14天均不长菌时，随机取10个试样（非阳性打孔试样），接种缺陷短波单胞菌菌悬液，在30℃~35℃培养7天，观察菌种生长情况，且鉴定菌种，确认培养基促生长能力。

将30个经121℃ 15min灭菌的试样（非阳性打孔试样），倒置浸没在菌悬液中4h，30℃~35℃培养7天，该组试样为试验组；取10个经121℃15min灭菌的试样，不浸入菌悬液中，该组试样为阴性对照组；5组阳性打孔试样（3.75μm，5μm，10μm，15μm，20μm），每组10个浸入菌悬液中4h，30℃~35℃培养7天，该组试样为阳性打孔对照组，进行微生物侵入法实验验证，结果显示：

①试验组、阴性对照组培养基澄清、无菌生长；

②阳性打孔对照组 3.75μm 3个长菌，泄露率30%；

阳性打孔对照组5μm 5个长菌，泄露率50%；

阳性打孔对照组10μm 9个长菌，泄露率90%；

阳性打孔对照组15μm 10个长菌，泄露率100%；

阳性打孔对照组20μm 10个长菌，泄露率100%；

且确认生长菌种为缺陷短波单胞菌。

由此确定微生物挑战实验灵敏度为15μm。

（2）真空衰减法

真空衰减法是一种无损的定量测试方法，可用于评估容器的密封性能。其原理是将样品放入测试腔体内，然后对测试腔体抽真空，通过容器内外的压差，容器内的气体会通过漏孔进入测试腔体。压力传感器会检测到压力的变化，将其与参考压力值进行比较，从而确定容器是否泄漏。

在进行密封性方法验证之前，可以先委托机构制备阴性样品（即实心体）、阳性样品（包括3.75μm、5μm、10μm）以及大漏样品（不带胶塞的注射剂瓶）。然后，使用仪器的经验参数对真空衰减法的密封性方法进行开发。如果分辨能力不强，可以调节参数以获得合理的结果。

在进行密封性方法验证时，可按照以下要求进行操作：

①灵敏度验证

用流量计进行模拟泄露孔径，气体泄露率与泄露孔径尺寸对应关系详见表1。打开流量计在0.00ccm、0.08ccm、0.12ccm、0.21ccm依次进行20次重复测试，本品0.12ccm时20次测试结果均为不通过，可知检出限为0.12ccm。

表2 气体泄漏率与泄漏孔径尺寸对应关系

②专属性验证

随机对阴性样品、阳性样品（3.75μm、5μm、10μm）及流量计模拟的泄漏0.12ccm（检测限级别）进行测试，结果显示：阴性样品检测结果均为通过；阳性样品（检测限及以上级别的3.75μm、5μm和10μm阳性瓶）检测结果均为不通过；流量计模拟的泄漏（检测限级别0.12ccm）检测结果均为不通过。说明方法的专属性较好。

③线性分别测试阴性样品，0.03ccm、0.05ccm、0.12ccm、0.21ccm、0.86ccm，每个测试点测试6次，取压差平均值，以压差平均值与测试点做出线性曲线图，求其方程和r2，得到r2为0.9998，不低于0.995，线性通过。

④准确度阴性样品重复测定10次，测试结果均为通过；流量计模拟的泄漏（检测限0.12ccm及以上一个级别0.21ccm）测试结果均为Fail，能够使不漏的样品和流量计模拟的泄漏结果得到区分，符合标准。说明方法的准确度较好。

⑤重复性、中间精密度由一实验员测试3.75μm阳性样品6次，得出6次压差RSD为3.2%≤10%；再由另外实验员于不同时间测试的3.75μm阳性样品6次，得出6次压差RSD为4.2%≤10%，且12次压差RSD为3.1%≤10%，说明此方法重复性、中间精密度较好。

⑥耐用性将测试方法中测试时间减少1s和增加1s，分别测试阴性样品、3.75μm阳性样品，每个测试6次，阴性样品结果均为合格，3.75μm阳性样品均为不合格。说明方法耐用性好。由此验证可知该方法灵敏度为3.75μm。

（3）拟定生产阶段的密封性检查

由上可知，微生物侵入法灵敏度为15μm，真空衰减法灵敏度为3.75μm，真空衰减法灵敏度高于微生物侵入法，选择真空衰减法作为该产品日常密封性检测方法。

参考文献：

1、国家药品监督管理局药品审评中心.《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南（试行）》（2020年第33号）

2、国家药品监督管理局药品审评中心.《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求》（2020年第2号）

3、USP <1207> Package integrity evaluation-sterile products.

4、USP <1207.1> Package integrity testing in the product life cycle-test method selection and validation.

5、USP <1207.2> Package Integrity Leak Test Technologies.

6、USP<1207.3> Package Seal Quality Test Technologies.

7、《药品GMP指南 无菌药品》中国医药科技出版社, 2011.

转载：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzUxOTgxNzg4NA==&mid=2247553006&idx=2&sn=5b7233dd0733de32b753afb0dbe29d07&chksm=f9f1901dce86190b62b5ececf027d1130a62162710948c54050cdb172d26d55b284dfb34aef5&scene=27‍‍